實(shí)驗有其目的有其原理，您看題目知道我們本次的實(shí)驗是查看細(xì)胞的生長存活，我們今天使用的方法名稱為四唑鹽比色法，四唑鹽也叫MTT。本次實(shí)驗有些特別哦！實(shí)驗的作用出標(biāo)題中目的，還有兩個，它還可以大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定、生物活性因子的活性檢測。
    一次實(shí)驗，四種作用：用四唑鹽比色法實(shí)驗查看細(xì)胞的生長與其存活。在實(shí)驗之前您需要先了解一下應(yīng)該明確知道哪些問題，當(dāng)然啦，上海恒遠(yuǎn)已經(jīng)為您整理出來了，下面我們來分條逐步看：
    1、選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時約有105個細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。
    2、藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細(xì)篩。不然可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。
    3、時間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時間點(diǎn)的測定OD值，輸入excel表，zui后得到不同時間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了那個時間點(diǎn)應(yīng)該就是的時間點(diǎn)，因為這個時候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的zui明顯。
    4、培養(yǎng)時間。200 ul的培養(yǎng)液對于10的4~5次方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持68 h，如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48 h換液的。
    5、MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞數(shù)。做MTT時，盡量無菌操作，因為細(xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高。
    6、理論未必都是對的。要根據(jù)自己的實(shí)際情況調(diào)整。
    7、實(shí)驗時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。
    8、避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時，高的血清物質(zhì)會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。
    第二部是貼壁細(xì)胞：
    1、收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 ul，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1 000-10 000孔，邊緣孔用無菌PBS填充。
    2、5% CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個梯度，每孔100 ul，設(shè)3-5個復(fù)孔.建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況。
    3、5% CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
    4、每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。
    5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。
    6、每孔加入150 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
    7、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。
    做完了貼壁細(xì)胞之后，我們再看看懸浮細(xì)胞：
    1、收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)?br />① 補(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40 ul ；
② 加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培養(yǎng)液稀釋 （儲存液100 ug/ml，需預(yù)試尋找*稀釋度，1：10-1：20）；
③ 需檢測物10 ul；
④ 細(xì)胞懸液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100 ul 1640）。
    2、置37℃，5% CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
    3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）
    4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。 
    5、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。
    MTT的配制：一般現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4oC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就不能再用了。
    上海恒遠(yuǎn)提醒您：MTT有致癌性，用的時候小心，有條件帶那種透明的簿膜手套。配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉.
    配制MTT時用PBS溶解，也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。
1、PBS配方
① NaCl ：8 g。
② KCl 0.2：g。
③ Na2HPO4 ：1.44 g。
④ KH2PO4：0.24 g。
⑤ 調(diào)pH7.4。
⑥ 定容1 L。
    zui后一步啦，細(xì)胞的接種（鋪板）：
    細(xì)胞過了30代以后就不要用了，因為狀態(tài)不好了；培養(yǎng)板要用好的（進(jìn)口板），不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實(shí)驗。接種時按照預(yù)實(shí)驗摸索出的密度接種， 因為細(xì)胞密度在10000/ml左右時，所測得的OD值的區(qū)間即細(xì)胞抑制率（或者增值率）的所呈現(xiàn)的線性關(guān)系，結(jié)果zui可信。如果鋪的太稀細(xì)胞的殺傷不會很明顯，太密細(xì)胞可能都會凋亡，因為細(xì)胞長的太快營養(yǎng)會不夠，zui后導(dǎo)致死亡。且而細(xì)胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關(guān)系不佳。故而MTT細(xì)胞密度多采用10000/ml，100 ul/孔。
    細(xì)胞密度要根據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)來定.如果你做的藥品對細(xì)胞具有刺激作用那么取小點(diǎn)的細(xì)胞濃度，如果你做的藥品對細(xì)胞具有抑制作用那么取大點(diǎn)的細(xì)胞濃度，這樣與對照的區(qū)別更明顯，數(shù)據(jù)更好。懸浮細(xì)胞每孔的細(xì)胞數(shù)可達(dá)到105，貼壁細(xì)胞可為103-104。
    到這里就算是基本說完了，本實(shí)驗有點(diǎn)復(fù)雜，所以朋友們要小心并且有耐心哦！zui后呢，上海恒遠(yuǎn)在這里再給朋友們說說實(shí)驗中有哪些注意事項。首先就要選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度，還有要避免血清干擾，一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗，在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。設(shè)空白對照：與試驗平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，zui后比色以空白調(diào)零。MTT實(shí)驗吸光度zui后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關(guān)系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50％抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。
    一次實(shí)驗，四種作用。感謝您對本公司的支持，我公司的產(chǎn)品質(zhì)量都是可以保證的，并且試劑盒提供免費(fèi)代測，其它產(chǎn)品實(shí)驗中，您有任何問題都可以來電，我們可提供實(shí)驗技術(shù)指導(dǎo)。歡迎您電詢上海恒遠(yuǎn)何。