2.4  結(jié)合物的保存

酶標(biāo)抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當(dāng)，極易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn) 定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時(shí)需經(jīng)復(fù)溶，頗為不便。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普 通冰箱的冰格中較長(zhǎng)時(shí)間保存。早期的ELISA試劑盒中的結(jié)合物一般均按以上兩種形式供應(yīng)，配以稀釋液（見3.2.5）臨用時(shí)按標(biāo)明的稀釋度稀釋成工作 液。現(xiàn)在較先進(jìn)的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達(dá)6個(gè)月。由于蛋白質(zhì)濃度較低，結(jié)合物易失活， 需加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉），以防止細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.5 結(jié)合物的稀釋液

用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%牛血清白蛋白）， 通過競(jìng)爭(zhēng)以抑制結(jié)合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測(cè)定抗體時(shí)， 血清標(biāo)本需稀釋后進(jìn)行測(cè)定，也可應(yīng)用這種稀釋液。

3. 酶的底物

3.1HRP的底物

HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)，具代表性的過氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下：

DH2+ H2O2 D+ H2O

上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測(cè)定。常用的供氫體有鄰苯 二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和 ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。

OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅 色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。 曾有報(bào)道OPD有致異變性，操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般 分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時(shí)用蒸 餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液，只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。

TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對(duì)比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另 外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸 收波長(zhǎng)為405nm。

ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。

另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計(jì)測(cè)量。用于ELISA的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定量測(cè)定的線性范圍。

HRP對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應(yīng)用最多，但尿素過氧化物為 固體，作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年。

3.2　AP的底物

AP為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色 的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光 測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。

4.  洗滌液

在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。

5. 酶反應(yīng)終止液

常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

6. 陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品

陽性對(duì)照品(positive control)和陰性對(duì)照品(negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì) 照，因此對(duì)照品，特別是陽性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測(cè)定，對(duì)照品最好也為人血清，因?yàn)檎Ｈ搜逶诟鞣N ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到，國(guó)外試劑盒中的對(duì)照品多以復(fù)鈣人血漿 (recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相 似。陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)，確定其中不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。陽性對(duì)照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量最好在試劑說明書中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱，在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較， 可對(duì)標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個(gè)粗略的估計(jì)。國(guó)外檢測(cè)HBsAg的ELISA試劑盒檢測(cè)敏感度約為0.5ng/ml，陽性對(duì)照品中含量約為10ng/ml。 在對(duì)照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。

7. 參考標(biāo)準(zhǔn)品

定量測(cè)定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。