1．溶液I—溶菌液：

    溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。

    葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。

    EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應(yīng)要求有較低的離子強度的環(huán)境。

    2．溶液II－NaOH－SDS液：

    NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH＞12或pH＜3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時，該系統(tǒng)的pH就高達12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。

    SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。（2）解聚細胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。

    3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：

    NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SDS－蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更*。

    4．為什么用無水乙醇沉淀DNA？

    用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。

    DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的終含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95％乙醇昂貴）。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵，后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15－30分鐘即可。

    5．在用乙醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAc或NaCl至終濃度達0.1～0.25mol/L？

    在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的tong性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不*，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進行洗滌或重沉淀。

    6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來處理？

    加進去的RNase本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加*。也可用飽和酚、氯fang抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。

    7．為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？

    在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa＝7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等雖然也都符合細胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實驗時，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2＋產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應(yīng)時，不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。

    8．如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來沉淀DNA？

    采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1％左右，小分子所需PEG濃度高達20％。本實驗選擇性沉淀4.3kb的pBR322質(zhì)粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其終PEG濃度為12％。PEG選擇性沉淀DNA的分辨率大約100bp。

    9．抽提DNA去除蛋白質(zhì)時，怎樣使用酚與氯fang較好？

    酞與氯fang是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯fang混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯fang擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯fang有機溶劑比重更大，保留在下層。

    作為表面變性的酚與氯fang，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯fang的變性作用不如酚效果好，但氯fang與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯fang效果hao。經(jīng)酚次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯fang是互溶的，可用氯fang第二次變性蛋白質(zhì)，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯fang混合（1:1）使用。

    10.為什么用酚與氯fang抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？

    在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯fang與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯fang與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯fang與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。