前言：任何的診斷試劑離不開的原料，如抗原抗體，酶等。以前用于免疫測定的抗原通常為各種純化抗原，而抗體則為純化抗原免疫動物后獲得的多克隆抗體和使用雜交瘤技術(shù)得到的單克隆抗體，而抗原或抗體的標(biāo)記物如酶標(biāo)結(jié)合物則通過各種制備。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或抗體及其酶結(jié)合物等免疫測定試劑幾成為現(xiàn)實(shí)的新一代試劑，各種新型使用的測定方法也不斷出現(xiàn)。
1、標(biāo)本采集：
1.1當(dāng)標(biāo)本采集保存不當(dāng)產(chǎn)生溶血時(shí)，紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放到血清中，血紅蛋白具有過氧化物酶的性質(zhì)，其通過吸附或“PP效應(yīng)"（蛋白質(zhì)間相互吸附的現(xiàn)象）結(jié)合后，可催化A、B液顯色而造成假陽性
1.2標(biāo)本采集保存不當(dāng)致細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)；標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過長導(dǎo)致血清IgG聚合，易使間接法的試驗(yàn)本底加深。因此，標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測。
1.3反復(fù)凍融血清會使抗體效價(jià)跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存做多次檢測，宜少量分裝凍存。
2、加樣：
2.1如果 樣品稀釋液少加或血清多加，都會引起本底增高。對于間接法來說，受上述兩個(gè)因素影響更大。因?yàn)檠逯惺軝z的特異性IgG只zhanIgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng)，非特異性IgG可直接吸附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異性的IgG均可以和酶標(biāo)二抗發(fā)生反應(yīng)而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多，高于規(guī)定的稀釋倍數(shù)，極易造成高值陰性。反之，造成假陰性。
2.2  如果加入的酶結(jié)合物過多或加在較高的孔壁上或孔口，也會引起本底升高或假陽性。
2.3如果血液未開始凝固或凝固不*時(shí)就強(qiáng)行離心分離血清，此時(shí)的血清中仍留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果。
3、溫育：
3.1  由于ELISA試驗(yàn)在一定溫度下的反應(yīng)時(shí)間并不是反應(yīng)的終點(diǎn)，溫育時(shí)間過短、溫度過低，易致顯色不全；溫育時(shí)間過長、溫度過高，易致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗*，產(chǎn)生陰性高值或假陽性反應(yīng)。因此，要嚴(yán)格按規(guī)定的溫度和溫育時(shí)間進(jìn)行。
3.2  由于水浴較難將溫度控制在穩(wěn)定的范圍，因此我們每次試驗(yàn)時(shí)應(yīng)認(rèn)真觀察水浴箱的溫度，盡量少開啟水浴箱門，嚴(yán)格控制水浴的溫度為37±0.5。同時(shí)，微孔板不可重疊放置，以保證傳熱均勻，各板的溫度都能迅速達(dá)到平衡。
3.3  由于試劑盒通常設(shè)定的反應(yīng)溫度為37度，在這個(gè)溫度下溫育一定時(shí)間，蒸發(fā)的水分會很多，對于整個(gè)反應(yīng)體系來講，各種反應(yīng)物的濃度會不斷地增加，這樣必會導(dǎo)致反應(yīng)zui后的值升高。因此溫育時(shí)應(yīng)貼上封板膠。